2.2 PLPRo蛋白结晶及晶体结构解析

    2.3 PLPRo的酶活检测及数据处理

第三章 结果及分析

    3.1 PLPRo酶活鉴定

    3.2 PLPRo的结构生物学研究

        3.2.1 PLpro蛋白单体结构特征

        3.2.2 PLpro与GRL0617复合物晶体结构

笫四章 结论和讨论

参考文献

附录:缩略词表

致谢

论文发表情况

文章摘要:甲型肝炎病毒（HAV）是微小RNA病毒科（Picornavirus）肝炎病毒属中的唯一成员。在整个微小RNA病毒家族中,甲肝病毒具有其独特性。目前,HAV仍然是世界范围内引起传染性肝病的主要病原体之一。虽然HAV感染的症状一般是轻微的,但仍然有一小部分甲肝病毒感染患者,特别是50岁以上的感染者,可能会死于急性肝炎。令人欣慰的是,现有的HAV疫苗可以提供有效和持久的免疫保护。尽管如此,即使是在卫生条件良好的发达国家,偶尔也会发生甲型肝炎病毒感染爆发的情况。为了能够快速遏制甲肝病毒的爆发,治疗急性甲型肝炎患者以及控制潜在的疫苗逃逸变异株,开发有效的抗HAV药物,在疾病控制中仍然具有重要价值。甲肝病毒与许多微小RNA病毒相比,甲肝病毒颗粒的结构具有典型的微小RNA病毒和昆虫类小核糖核酸病毒的共同特征。HAV的二十面体衣壳（直径约27 nm）非常光滑,没有形成结构蛋白间的“狭沟”,这种结构特征符合其承受高温和低pH环境的特点。HAV的基因组是一个约7.5 kb的正义单链RNA,其中包含一个5’端非翻译区（UTR）、一个大的开放阅读框（ORF）、一个3’端非翻译区和一个多聚的poly（A）尾。这个ORF编码一个多聚蛋白（～250 kDa）,通过病毒和细胞蛋白酶进行共翻译或翻译后切割后,产生4个成熟的结构蛋白（VP1-VP4）和7个非结构蛋白（2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D）以及一系列多功能蛋白前体。与典型的微小RNA病毒不同的是,HAV的2A蛋白不具有蛋白酶的功能,它是VP1的一部分,不成熟的病毒颗粒中包含有VP1蛋白的存在,但是在成熟的病毒颗粒中不存在。HAV的3C蛋白和3ABC前体蛋白是负责大多数病毒蛋白切割的关键的蛋白酶或蛋白酶前体。一直以来,2C蛋白被认为是SF3解旋酶家族成员,因此,根据这样的结果我们推测,HAV 2C具有ATPase和RNA结合活性,但与肠道病毒EV71的非结构蛋白2C相比,HAV 2C的双链解旋活性还从未被报道。全长的HAV 2C蛋白和缺乏N端膜结合区的截短体都表现出RNA结合活性,这可能意味着RNA结合位点不存在于N端的结构域。HAV 2C蛋白能够识别病毒负链RNA的3’末端的非翻译区,表明它可能能将负链RNA（正链RNA合成的模板）锚定到细胞内膜上。在之前的研究中,我们成功解析了缺乏N端的两亲性螺旋结构域的肠道病毒EV71 2C和PV2C蛋白的晶体结构。根据已有的研究,我们认为,肠道病毒2C蛋白的C端结构域都是由一个ATPase结构域,一个锌指结构域和一个C端两亲螺旋结构域组成。肠道病毒EV71 2C蛋白的C末端螺旋与相邻2C的疏水口袋区具有明确的相互作用,并介导特定的2C-2C之间的相互作用,这对2C的ATPase活性和病毒复制至关重要。由此,我们提出了肠道病毒2C的六聚体模型,在其中心包含着带负电荷的孔道。研究进化分支较早的微小RNA病毒家族成员——甲肝病毒2C蛋白,对于了解微小RNA病毒2C蛋白的分子进化至关重要。因此,我们从结构、生化和功能三个方面对HAV 2C蛋白进行了研究。首先,我们解析了 HAV 2C蛋白的C端结构域,其中包括整个ATPase结构域,一个相当于肠道病毒2C锌指结构域的区域（ZFER）和C端两亲螺旋结构域。与之前的2C结构相似的是,HAV 2C的C端螺旋结构域能够结合相邻2C的疏水口袋（Pocket）,介导特定的2C-2C相互作用。通过2C蛋白的关键位点突变实验,我们发现PBD（Pocket-Binding-Domain）-Pocket相互作用对于2C蛋白的自我寡聚化和ATP酶活性以及HAV病毒复制至关重要。然后,我们对2C蛋白的生化活性进行分析,我们发现HAV 2C对单链RNA表现出核糖核酸酶活性,并且对多聚尿嘧啶具有偏好性。此外,我们发现,HAV2C的核糖核酸酶活性与ATP酶活性无关。通过进一步的突变实验,我们发现了三个影响核糖核酸酶活性的关键酸性氨基酸残基;病毒复制子实验表明,这些氨基酸残基所负责的核酸酶活性是HAV转录复制的基础。最后,我们发现,在整个2C蛋白家族中,这些酸性氨基酸残基位于较为保守的区域,我们对其他的微小RNA病毒的2C蛋白的核糖核酸酶活性进行了鉴定,其中包括EV71 2C、FMDV 2C、CVB3 2C、PV 2C和HRV 2C等,结果表明,它们都具有相似核酸酶的活性。该研究解析了甲肝病毒2C蛋白的C端晶体结构,并且首次发现了 2C蛋白具有单链的核酸酶活性,并且发现了核酸酶活性中心负责核酸催化的关键氨基酸,对2C蛋白在病毒转录复制中的功能研究奠定了良好的基础,为设计靶向2C蛋白的药物提供良好的结构和功能基础。新冠病毒引发的大流行正在前所未有的继续爆发和蔓延。到目前为止,仍然没有有效的治疗或预防手段来减缓或抑制这场危机。SARS-CoV-2的木瓜蛋白酶（PLpro）在病毒复制和免疫逃避中起着至关重要的作用,是一个非常有效的抗病毒的药物靶点。鉴于SARS-CoV-2和SARS-CoV的PLpro蛋白酶具有显著的同源性,以SARS-CoV PLpro开发的抑制剂为源头,是开发抗新冠抑制剂的一个充满希望的起点。在这项研究中,我们以PLpro为目标,寻找能够靶向该蛋白的抑制剂,从而能够为针对该蛋白的药物设计提供思路。首先,我们确定了 SARS-CoV-2 PLpro突变体C111S的单体结构,该蛋白具有与SARS-CoV PLpro相同的许多结构特征。这种蛋白酶的晶体形状具有独特的堆积、高溶剂含量等特征,最终,我们获得了 2.5A分辨率的晶体结构,因此,这就为使用晶体学方法进行基于片段的筛选提供了良好的可能性。然后,我们表征了 PLpro在切割含有nsp2/nsp3接头的合成肽中的蛋白酶活性。最后,我们证明了一种有效的SARS-CoV PLpro抑制剂GRL0617在抑制SARS-CoV-2的蛋白酶活性方面也十分有效,其IC50为2.2±0.3μM。随后,我们解析了 GRL0617和SARS-CoV-2 PLpro复合物的结构,其分辨率为2.6 A,结构显示,抑制剂占据了蛋白底物结合区域的S3-S4 口袋内。GRL0617的结合能够诱导BL2环的闭合并使底物结合裂缝变窄,而四肽底物的结合扩大了裂缝。因此,我们的结果阐明了 GRL0617抑制的分子机制,即GRL0617不仅占据底物口袋,而且还密封底物结合裂缝的入口,从而阻止底物的LXGG基序与蛋白的结合,最终导致蛋白酶功能的丧失。

文章来源：《中国医学科学院学报》 网址: http://www.zgyxkxyxbbjb.cn/qikandaodu/2022/0309/703.html